1 、熒光免疫測(cè)定技術(shù)的概念:將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后,測(cè)定復(fù)合物中的熒光素,這種免疫技術(shù),稱為免疫熒光素技術(shù)。
2、熒光的產(chǎn)生:
物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài),在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放,即發(fā)光,這種光稱為熒光。這種物質(zhì),稱為熒光素。
由光激發(fā)所引起的熒光,為光致熒光
------熒光免疫技術(shù)
由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光,為化學(xué)熒光
------化學(xué)發(fā)光技術(shù)
3、熒光素的熒光特性:
⑴ 停止供能,熒光現(xiàn)象隨即終止
⑵ 對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性,綠色熒光選藍(lán)色為激發(fā)光,紅色熒光選綠色為激發(fā)光
入射光波長<發(fā)射光波長
⑶ 熒光效率: 發(fā)射熒光的光量子數(shù)
熒光效率=----------------------------
吸收光的光量子數(shù)
⑷ 熒光猝滅現(xiàn)象:熒光素的輻射能力減弱
常見熒光素的特性:
⑴ FITC:黃色結(jié)晶粉末,吸收光(藍(lán)色激發(fā)光):490~495nm,
發(fā)射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。
4、熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般為四級(jí),即“—”無或可見微弱自發(fā)熒光。“+”僅能見明確可見的熒光。“++”可見有明亮的熒光。“+++”可見耀眼的熒光。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,而各種對(duì)照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。
5、普通熒光顯微鏡的操作指南
(1)關(guān)閉房間內(nèi)的電燈,開啟顯微鏡汞燈。為延長汞燈的使用壽命,汞燈開啟不到15-30分鐘的請(qǐng)?jiān)?5-30分鐘后關(guān)閉汞燈。再次打開汞燈電源的間隔時(shí)間也應(yīng)該在15-30分鐘以上,避免反復(fù)開關(guān)。
(2)根據(jù)樣品熒光素選擇相應(yīng)熒光組件。使用減光片對(duì)熒光強(qiáng)度適當(dāng)調(diào)整(因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度不可調(diào),所以只能使用各種減光片來調(diào)整觀察效果)
(3)選擇濾光片。常用的有綠、藍(lán)、紫、紫外等,分別對(duì)應(yīng)不同的激發(fā)光波長。
(4)放好染色切片,找到合適的視野。在熒光狀態(tài)下觀察標(biāo)本,標(biāo)本內(nèi)的熒光會(huì)較快的衰減,所以要避免長時(shí)間的在熒光下觀察,可以先在明場(chǎng)下調(diào)整好要觀察的位置再使用熒光。
(5)需拍照先確認(rèn)照相機(jī)已裝好。
(6)使用結(jié)束關(guān)閉所有電源并做好使用記錄。
(7)如需詳細(xì)說明,請(qǐng)借閱說明書。
操作流程(SABC- FITC)三步發(fā)光法
細(xì)胞爬片
蓋玻片的處理:先用洗潔精沖洗干凈(用大號(hào)的培養(yǎng)皿,將玻片平鋪在上面,把洗潔精弄出泡泡,放在水平搖床上搖30min~60min)→用自來水沖洗干凈(先放在水上沖,再加上自來水在搖床上搖約30min×3次)→將濃硫酸加入培養(yǎng)皿中,泡酸24 h→自來水沖洗干凈→ddH2O沖洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用紗布將玻片平攤開來,隔層包裹→置于飯盒中高溫高壓消毒
↓
細(xì)胞長滿,0.25%胰酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù),接種至6孔板,每孔約3ml細(xì)胞懸液,加完后在邊上輕輕吹幾下,十字形晃動(dòng)數(shù)次,保證細(xì)胞在蓋玻片上均勻覆蓋。(注意:1、預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),摸一個(gè)的細(xì)胞量,一般3~5×105為宜;2、先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,造成雙層細(xì)胞貼片。3、整個(gè)過程注意無菌操作。)
↓
培養(yǎng)24h,待細(xì)胞接近60%~70%匯合
↓
取出六孔板,浸入0.01MPBS,約3ml/孔,于搖床上搖5min×3次
↓
固定:
4%多聚甲醛固定30min(室溫),約2ml/孔
↓
棄干凈液體,(用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次)浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
↓
破膜:
加0.1%TritonX-100,20min,室溫,約2ml/孔
↓
棄干凈液體,(用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次)浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
↓
消除非特異性反應(yīng):
浸入0.75%H2O2,在37℃作用30min(配方:1ml30%H2O2+39ml 0.01M PBS,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存)
↓
棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
↓
以下操作均在濕盒中進(jìn)行
封閉:
↓
滴加用0.01M PBS1:10稀釋的正常血清封閉液,37℃,30min(注意:150ul/孔;吸去多余的液體,不要洗)
↓
免疫反應(yīng):
滴加0.01M PBS按一定比例稀釋的一抗,150ul/孔(稀釋度,一般取推薦濃度的中間值),37℃,30min后,4℃過夜
↓
復(fù)溫,室溫放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育,總時(shí)長在16~18h】
↓
棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
↓
滴加0.01M PBS 1:100稀釋的生物素化二抗,150ul/孔,37℃,30min
↓
棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次
↓
發(fā)光:(此操作一定要避光,可以將搖床拿入暗室當(dāng)中,)
↓
滴加0.01M PBS 1:100稀釋的SABC-FITC,150ul/孔,37℃,30min
↓
棄干凈液體,浸入0.01MPBS,5min×3~4次(一定要洗干凈,否則背景會(huì)很高)
↓
取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了
↓
緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察
注意事項(xiàng):
1、在六孔板間隙的孔中加入0.01M PBS,制成濕盒環(huán)境。
2、需設(shè)空白對(duì)照。從加一抗開始,空白對(duì)照組全部用0.01M PBS。
3、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過長 ,會(huì)使熒光減弱。
4、需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。
5、所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。
試劑配制:
1、0.01M PBS 1000ml 2000ml 5000ml
NaCl 8.5g 17.0g 42.5g
NaH2PO4.2H2O 0.3g 0.6g 1.5g
Na2HPO4.12H2O 2.9g 5.8g 14.5g
2、0.1%TritonX-100
TritonX-100 100ul 定容至 常溫保存?zhèn)溆?/span>
0.01M PBS 100ml 100ml
3、4%多聚甲醛
多聚甲醛 4g 60℃約5min+2滴2mol/L 搖晃 ,定容至100ml
0.01M PBS 100ml NaOH助溶 PH=7.2 4℃保存,2周用完
4、0.75% H2O2
30% H2O2 1ml 現(xiàn)用現(xiàn)配,
0.01M PBS 39ml 4℃避光保存
電話
微信掃一掃